白花蛇舌草对裸鼠宫颈癌细胞增殖和凋亡的实验研究(2)
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2010年10月25日
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1.3 实验方法
1.3.1 裸鼠宫颈癌移植模型的建立
裸鼠40只，雌性，4~6周龄，体重18~20 g，购于中国科学院上海实验动物中心。裸鼠饲养于恒温(22~25℃)、恒定湿度的SPF(specific pathogen free condition)层流罩中。经高压灭菌的标准饲料和水供动物自由饮食。培养的HeLa细胞经胰酶消化后离心，用PBS液清洗2次；将细胞团块吹散，经台盼蓝实验证实细胞活力大于95%；取HeLa细胞2×106个(0.2 ml) 接种于裸鼠背部皮下组织内，动物继续饲养于层流罩内，观察2周，成瘤率为100%。
1.3.2实验动物分组与给药
当肿瘤生长至直径10 mm时开始实验，将荷瘤鼠随机分为两大组，每组20只小鼠，再随机分成两个小组，分别用于观察抑瘤率和生存时间。①对照组：荷瘤鼠不加以治疗，继续饲养至实验结束(n=10)；②白花蛇舌草组(实验组)：白花蛇舌草水煎液灌胃，以5.0 ml/(kg·次·只)给药，1次/d，共10次(n=10)。白花蛇舌草灌胃水煎液制备：白花蛇舌草300 g加水3 000 ml，温火煎煮2 h，去渣浓缩为300 ml备用。
1.3.3观察指标和检测
1.3.3.1抑瘤率观察荷瘤对照组裸鼠(n=10)不加以治疗，继续饲养至实验10 d。给药组(n=10)：白花蛇舌草水煎液灌胃，每天1次，第10天停止给药，次日采用颈椎脱臼法杀死小鼠后，在无菌条件下取出小鼠肿瘤分别称重，计算抑瘤率。抑瘤率=(C﹣T)/C×100%。其中T为实验组平均瘤重，C为对照组平均瘤重，称重后组织常规固定进行病理检查。
1.3.3.2生存时间观察对照组和白花蛇舌草组(n=10)，喂养动物直至死亡，计算荷瘤小鼠的平均生存时间。
1.3.3.3小鼠宫颈癌肿瘤组织Ki-67蛋白表达免疫组化检测将裸鼠肿瘤组织石蜡包埋切片，常规二甲苯脱蜡，梯度酒精脱水，接着浸入配制好的柠檬酸/柠檬酸钠中，95℃水浴10 min，后用0.3% H2O2室温作用30 min，消除内源性辣根过氧化物酶活性。PBS洗后用血清封闭，室温1 h后PBS洗1遍，上一抗(Ki-67抗体，1∶100)4℃ 48 h。48 h后吸去一抗，PBS洗3遍，以后的操作按Vect ABC试剂盒进行，即生物素标记的二抗4℃过夜，PBS洗3遍，辣根过氧化物酶(HRP)标记的生物素卵白素复合物，37℃ 1 h。PBS洗4遍，最后DAB显色，镜检控制结果。然后梯度酒精脱水、二甲苯透明，中性树脂封片，光镜下观察。
每批染色均设阳性对照与阴性对照，用已知阳性片作阳性对照，对照实验为以磷酸缓冲液(PBS)代替一抗，其余操作相同。
1.3.3.4小鼠宫颈癌肿瘤组织凋亡检测(TUNEL法)采用ApopTagR Peroxidase In Situ Apoptosis Detection 试剂盒，按说明书操作行TUNEL染色。石蜡包埋切片(5 mm)，常规二甲苯脱蜡，梯度酒精脱水，蛋白酶K20 μg/ml室温消化20 min, 在TdT酶和核苷酸混合液中孵育37℃ 1 h，用stop/wash buffer 停止反应，在anti-digoxigenin conjugate室温孵30 min，最后DAB显色，苏木素复染，梯度酒精脱水、二甲苯透明，中性树脂封片，光镜下观察。凋亡细胞核呈现棕黄色。
1.4统计学方法
实验结果以均数±标准差(x±s)表示，采用t检验或方差分析，以SPSS 14.0软件处理。
2结果
2.1白花蛇舌草对HeLa细胞荷瘤小鼠抑瘤率的影响
用白花蛇舌草水煎液灌胃，可明显抑制宫颈癌HeLa细胞肿瘤的生长，未经治疗的对照组的平均瘤重为(1.61±0.30) g，而经白花蛇舌草治疗的HeLa细胞荷瘤小鼠平均瘤重为(1.03±0.26) g，抑瘤率为36.1%，实验组瘤体减小与对照组比较，差异有统计学意义(P<0.05)。如图1。
2.2白花蛇舌草对宫颈癌HeLa细胞荷瘤小鼠平均生存时间的影响
未经治疗的对照组的平均生存时间为(13.3 ±1.1) d，而经白花蛇舌草治疗的HeLa细胞荷瘤小鼠平均生存时间为(19.4 ±1.9) d，生存时间延长率(%)为46.6%。P< 0.05，差异有统计学意义。对照组的最长生活时间为25 d，而白花蛇舌草治疗组最长的生存时间为34 d。如图2。
2.3 白花蛇舌草对宫颈癌荷瘤小鼠HeLa细胞Ki-67抗原蛋白的表达率
免疫组化检测肿瘤组织Ki-67蛋白的表达率，阳性标准：Ki-67抗原蛋白表达阳性细胞表现为细胞核出现黄色或棕黄色着色。阴性为无角质形成细胞着色或角质形成细胞着色<5%。如图3。
对照组Ki-67表达的阳性细胞反应定位于细胞核，多呈黄色、深黄色和棕黄色颗粒，表达率为72%；而白花蛇舌草治疗组则没有此种表现，Ki-67的表达率仅为21.2%。
Ki-67蛋白表达阳性计数方法：放大400倍镜下计数5个视野，阳性细胞率=阳性细胞数/总细胞数×100%。阳性细胞数在5%~25%为(+)，26%~50%为(++)，51%~75%为(+++)，>75%为(++++)。阳性细胞反应定位于细胞核，多呈黄色和棕黄色颗粒，对照组Ki-67的表达率仅为21.2%，而白花蛇舌草治疗组的Ki-67的表达率为72%，两者相比，P<0.05，差异有统计学意义。见图4。
2.4白花蛇舌草对宫颈癌荷瘤小鼠HeLa细胞凋亡的影响
经TUNEL法检测，透射电镜观察显示，对照组小鼠的肿瘤组织无明显变化，而在实验组肿瘤瘤块内出现大面积的细胞坏死，坏死细胞结构不清、核深染、同时可见变小凋亡细胞以及核固缩等细胞凋亡征象，见图5。
白花蛇舌草实验组宫颈癌肿瘤细胞凋亡率为(60.43±0.17)%，与对照组凋亡率(3.09±0.21)%比较，差异有统计学意义(P<0.05)，见图6。
3讨论
恶性肿瘤是严重威胁人类健康的一类常见疾病，临床治疗肿瘤，西医一般采用手术、放疗、化疗三大疗法，疗效快捷，对早中期肿瘤有一定的根治效果，但存在明显的损伤和毒副作用。因此，寻找有效且无损伤和毒副作用的抗癌药物，寻找有效的药物和方法，是医学领域面临的重要问题。中草药是我国的传统医药,对于肿瘤的治疗，中药具有改善症状明显，副作用小等特点。中医认为，癌症的重要病理基础为正气虚衰、热毒内聚，恶性肿瘤临床常见症状、体征为发热、局部肿块增大、灼热、疼痛、口渴、尿黄、大便干结、舌质红苔黄、脉数等，都属于邪热瘀毒之象，故治疗以清热解毒为法则[1]。合理应用中医药，可对人体失衡的内环境进行调节，使正气内存 ......
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