何首乌致肝损伤大鼠的动态血清代谢组学研究(1)
[摘要]该文采用液相色谱质谱方法测定服用何首乌大鼠的血清代谢指纹谱，同时利用多元统计分析方法比较代谢谱差异并筛查显著相关的生物标志物，考察其动态变化趋势。探讨何首乌致大鼠肝脏损伤的代谢组学动态变化，寻找其显著相关的生物标志物，并考察标志物的动态变化趋势，以期为何首乌致肝损伤的内在机制与临床早期诊断提供依据。结果显示给药后不同时间点大鼠的血清代谢轮廓存在一定的差异，经比较分析，共筛选得到6个潜在生物标志物：oleamide，lysoPC(16∶0)，leukotriene A4，transtetradec2enoic acid，dihydrocortisol 和 7ahydroxydehydroepiandrosterone，这些标志物在何首乌致肝损伤动态过程中呈现一定的变化趋势。所筛选到的生物标志物在给药1周后含量即出现明显变化，相比于ALT，AST来说更加敏感。一定程度上可揭示出何首乌造成肝损伤的动态机制以及肝脏自我修复表现，对于监测服用何首乌患者肝功能、早期发现何首乌肝损伤具有潜在的应用价值和意义。
[关键词]何首乌； 肝损伤； 代谢组学； 动态变化； 早期诊断； 内在机制
, 百拇医药
近年来，中药引发的肝损伤事件较为频繁，尤其是一些传统不认为是有毒的中药如何首乌、决明子、大黄、柴胡、麻黄等的肝毒性问题日益突出[12]。何首乌始载于《开宝本草》，生何首乌性平，味甘、苦，归心、肝、大肠经；具有解毒、消痈、截疟、润肠通便的功效。制何首乌性微温，味甘、涩，归肝、肾经；具有补肝肾、益精血、乌须发、强筋骨、化浊降脂等功效，含有二苯乙烯苷、蒽醌、鞣质、磷脂和多糖等多种化学成分[3]。何首乌是传统补益类中药，与人参、灵芝和冬虫夏草并列为祖国“四大仙草”。而关于何首乌肝毒性的频发趋势更是愈演愈烈，检索知网数据库2005年至2014年10年间共有183例关于何首乌肝毒性的报道。近年来，国内外不断有文献报道因服用生、制何首乌或含何首乌相关制剂而导致黄疸、肝炎和肝功能异常等患者[45]。以至于2014年度国家食品药品监督管理总局药品不良反应中心公开通报口服何首乌及其成方制剂引起的肝损伤风险，并要求相关厂家根据品种实际和不良反应监测情况完善药品说明书的安全性信息等。
然而，何首乌致肝损伤的机制目前尚不明确，对其引发肝损伤的动态过程也缺乏有效的数据，因此导致临床上辨识和诊断较为困难。课题组前期对何首乌致肝损伤进行了系列研究，临床流行病学数据调查结果显示，何首乌致肝损伤与患者服药剂量、时间、性别、年龄均缺少明确的对应关系，具有特异质属性[6]，同时发现何首乌本身也存在潜在肝毒性，为了充分暴露何首乌潜在毒性，前期课题组采用大剂量何首乌醇提物，考察其对大鼠多臟器的损伤作用，结果从组织病理上可以看出何首乌大剂量提取物对肝脏有明显的损伤作用，但临床常用的ALT，AST转氨酶指标并无显著变化[7]。鉴于此，本文采用课题组前期实验的血清标本，对何首乌致肝损伤的大鼠进行动态血清代谢组学研究，旨在描述何首乌造成肝损伤的动态过程，运用代谢组学的方法寻找动态变化的生物标志物，初步探讨何首乌致肝损伤的体内代谢机制，以期为临床何首乌肝损伤的动态监测提供一定的依据，为临床何首乌致肝损伤的临床早期诊断提供辅助参考。
, 百拇医药
1材料与方法
11仪器与试剂高效液相色谱(Agilent 1200 HPLC，美国Agilent公司)四级杆飞行时间串联质谱仪(Bruker microTOFQⅡ，德国Bruker公司)，DataAnanlsis 工作站，Gradient A10 MillQ超纯水器(法国Millipore公司)，迈瑞BS300全自动生化分析仪(上海富众生物科学有限公司)，冷冻离心机(Sigma公司，德国)，微量分析天平(Mettler Toledo AL204 瑞士)，涡旋混匀器(HYQ 2121A)。生首乌购于北京绿野药业有限公司(批号10050904)，经解放军第三〇二医院肖小河研究员鉴定为蓼科植物何首乌Polygonum multiflorum Thunb的干燥块根；甲醇(色谱级，德国Merck公司)；去离子水经(182 MΩ) Millipore MilliQ 系统(Millipore Co，美国) 超纯水器净化，其他试剂均为市售分析纯。谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)检测试剂盒(南京建成科技有限公司)。
, http://www.100md.com
12动物SD大鼠，SPF级，体重160 g左右，雄性，共12只，购于军事医学科学院实验动物中心，合格证号SCXK军2007004。动物饲养于屏障动物房，室温(20±2) ℃，相对湿度60%～70%，通风良好、环境安静，室内保持12 h照明，12 h黑暗，并定期消毒。
13试药将生何首乌粉碎得粗粉，加6倍量的75%乙醇冷浸提取，共提取5次，每次48 h，合并醇浸提取液，浓缩并减压干燥，制得干粉备用。每次给药前按配制药液，水浴加热至37 ℃时使用。
14样本收集给药剂量为40 g·kg-1，按每200 g体重5 mL灌胃给药，连续给药28 d(4周)以制备肝损伤大鼠模型。给药期间大鼠自由饮食，每日观察给药前后每只动物的外观体征、行为活动、毛发变化、大小便形状、颜色及有无异常分泌物等。给药期间每7 d大鼠眼眶取血，分离血清后置于-80 ℃冰箱。
15样品预处理与LCMS/MSQTOF检测样品预处理：将大鼠血清于-80 ℃冰箱中取出，复融，取250 μL加入到15 mL EP管中，再加入750 μL的甲醇溶液，混匀，静置，4 ℃下冷冻离心(1万 r·min-1，10 min)，取上清，并用022 μm微孔滤膜滤过，备用。
LCMS/MSQTOF检测：采用Agilent ZORBAX SBC18(21 mm×150 mm，5 μm)色谱柱；柱温25 ℃，流速025 mL·min-1，进样量为20 μL，样品温度4 ℃，检测波长420 nm；流动相A：甲醇，流动相B：水；梯度洗脱(0～5 min：甲醇30%～90%；5～51 min：甲醇90%；51～40 min：甲醇90%～30%)；离子源ESI±；毛细管电压3 500V；相对分子质量数50～1 000；碰撞能7 eV；锥孔能5 eV；脱溶剂气流量60 L·min-1；脱溶剂气温度180 ℃。, http://www.100md.com(马致洁 李奇 赵奎君 王伽伯 肖小河)
[关键词]何首乌； 肝损伤； 代谢组学； 动态变化； 早期诊断； 内在机制
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近年来，中药引发的肝损伤事件较为频繁，尤其是一些传统不认为是有毒的中药如何首乌、决明子、大黄、柴胡、麻黄等的肝毒性问题日益突出[12]。何首乌始载于《开宝本草》，生何首乌性平，味甘、苦，归心、肝、大肠经；具有解毒、消痈、截疟、润肠通便的功效。制何首乌性微温，味甘、涩，归肝、肾经；具有补肝肾、益精血、乌须发、强筋骨、化浊降脂等功效，含有二苯乙烯苷、蒽醌、鞣质、磷脂和多糖等多种化学成分[3]。何首乌是传统补益类中药，与人参、灵芝和冬虫夏草并列为祖国“四大仙草”。而关于何首乌肝毒性的频发趋势更是愈演愈烈，检索知网数据库2005年至2014年10年间共有183例关于何首乌肝毒性的报道。近年来，国内外不断有文献报道因服用生、制何首乌或含何首乌相关制剂而导致黄疸、肝炎和肝功能异常等患者[45]。以至于2014年度国家食品药品监督管理总局药品不良反应中心公开通报口服何首乌及其成方制剂引起的肝损伤风险，并要求相关厂家根据品种实际和不良反应监测情况完善药品说明书的安全性信息等。
然而，何首乌致肝损伤的机制目前尚不明确，对其引发肝损伤的动态过程也缺乏有效的数据，因此导致临床上辨识和诊断较为困难。课题组前期对何首乌致肝损伤进行了系列研究，临床流行病学数据调查结果显示，何首乌致肝损伤与患者服药剂量、时间、性别、年龄均缺少明确的对应关系，具有特异质属性[6]，同时发现何首乌本身也存在潜在肝毒性，为了充分暴露何首乌潜在毒性，前期课题组采用大剂量何首乌醇提物，考察其对大鼠多臟器的损伤作用，结果从组织病理上可以看出何首乌大剂量提取物对肝脏有明显的损伤作用，但临床常用的ALT，AST转氨酶指标并无显著变化[7]。鉴于此，本文采用课题组前期实验的血清标本，对何首乌致肝损伤的大鼠进行动态血清代谢组学研究，旨在描述何首乌造成肝损伤的动态过程，运用代谢组学的方法寻找动态变化的生物标志物，初步探讨何首乌致肝损伤的体内代谢机制，以期为临床何首乌肝损伤的动态监测提供一定的依据，为临床何首乌致肝损伤的临床早期诊断提供辅助参考。
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1材料与方法
11仪器与试剂高效液相色谱(Agilent 1200 HPLC，美国Agilent公司)四级杆飞行时间串联质谱仪(Bruker microTOFQⅡ，德国Bruker公司)，DataAnanlsis 工作站，Gradient A10 MillQ超纯水器(法国Millipore公司)，迈瑞BS300全自动生化分析仪(上海富众生物科学有限公司)，冷冻离心机(Sigma公司，德国)，微量分析天平(Mettler Toledo AL204 瑞士)，涡旋混匀器(HYQ 2121A)。生首乌购于北京绿野药业有限公司(批号10050904)，经解放军第三〇二医院肖小河研究员鉴定为蓼科植物何首乌Polygonum multiflorum Thunb的干燥块根；甲醇(色谱级，德国Merck公司)；去离子水经(182 MΩ) Millipore MilliQ 系统(Millipore Co，美国) 超纯水器净化，其他试剂均为市售分析纯。谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)检测试剂盒(南京建成科技有限公司)。
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12动物SD大鼠，SPF级，体重160 g左右，雄性，共12只，购于军事医学科学院实验动物中心，合格证号SCXK军2007004。动物饲养于屏障动物房，室温(20±2) ℃，相对湿度60%～70%，通风良好、环境安静，室内保持12 h照明，12 h黑暗，并定期消毒。
13试药将生何首乌粉碎得粗粉，加6倍量的75%乙醇冷浸提取，共提取5次，每次48 h，合并醇浸提取液，浓缩并减压干燥，制得干粉备用。每次给药前按配制药液，水浴加热至37 ℃时使用。
14样本收集给药剂量为40 g·kg-1，按每200 g体重5 mL灌胃给药，连续给药28 d(4周)以制备肝损伤大鼠模型。给药期间大鼠自由饮食，每日观察给药前后每只动物的外观体征、行为活动、毛发变化、大小便形状、颜色及有无异常分泌物等。给药期间每7 d大鼠眼眶取血，分离血清后置于-80 ℃冰箱。
15样品预处理与LCMS/MSQTOF检测样品预处理：将大鼠血清于-80 ℃冰箱中取出，复融，取250 μL加入到15 mL EP管中，再加入750 μL的甲醇溶液，混匀，静置，4 ℃下冷冻离心(1万 r·min-1，10 min)，取上清，并用022 μm微孔滤膜滤过，备用。
LCMS/MSQTOF检测：采用Agilent ZORBAX SBC18(21 mm×150 mm，5 μm)色谱柱；柱温25 ℃，流速025 mL·min-1，进样量为20 μL，样品温度4 ℃，检测波长420 nm；流动相A：甲醇，流动相B：水；梯度洗脱(0～5 min：甲醇30%～90%；5～51 min：甲醇90%；51～40 min：甲醇90%～30%)；离子源ESI±；毛细管电压3 500V；相对分子质量数50～1 000；碰撞能7 eV；锥孔能5 eV；脱溶剂气流量60 L·min-1；脱溶剂气温度180 ℃。, http://www.100md.com(马致洁 李奇 赵奎君 王伽伯 肖小河)