杜仲不同炮制品化学成分研究(1)
[摘要]根据2010年版《中国药典》制备生杜仲、盐杜仲、杜仲炭3个规格炮制品，按照2010年版《中国药典》标准对各炮制品进行各项指标检测，均符合药典要求。运用HPLC-DAD对生杜仲、盐杜仲、杜仲炭及杜仲叶中化学成分进行比较分析，结果显示：①杜仲皮主要含有木脂素类化合物松脂醇二葡萄糖及环烯醚萜类化合物京尼平、京尼平苷、京尼平苷酸，而杜仲叶主要含有黄酮类化合物槲皮素和酚酸类化合物绿原酸；②杜仲皮中松脂醇二葡萄糖含量约是杜仲叶中含量的18倍，盐炙和炒炭后松脂醇二葡萄糖质量分数约分别下降30%，85%；③杜仲皮中京尼平、京尼平苷和京尼平甘酸含量约为杜仲叶中京尼平、京尼平苷和京尼平甘酸含量的3，23，28倍，盐炙后京尼平、京尼平苷和京尼平甘酸质量分数分别降低25%，40%，40%，炒炭后京尼平、京尼平苷和京尼平甘酸质量分数分别降低98%，70%，70%；④杜仲皮中咖啡酸含量约是杜仲叶中咖啡酸含量的3倍，盐炙后咖啡酸质量分数约下降50%，炒炭后咖啡酸质量分数下降约75%；杜仲皮中绿原酸含量约为杜仲叶中绿原酸含量的1/6，盐炙和炒炭后绿原酸质量分数分别下降40%，75%；杜仲皮中槲皮素含量仅为杜仲叶中1/40，盐炙和炒炭后槲皮素质量分数分别降低60%，50%。
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[关键词]杜仲；炮制品；液相色谱法
杜仲饮片为杜仲科植物杜仲的干燥树皮，中医临床常用其治疗肾虚腰痛、筋骨无力、妊娠漏血、胎动不安、高血压等[1]。杜仲的主要有效成分包括松脂醇二葡萄糖苷[2]、绿原酸、桃叶珊瑚苷、杜仲胶等[3]，一般以松脂醇二葡萄糖苷为主要指标性成分。盐炙和炒炭是杜仲最为常见的炮制方法，很多学者对杜仲盐炙和炒炭的工艺进行优化，提出了盐杜仲和杜仲炭的最佳炮制工艺及质量要求。本文按照2010年版《中国药典》附录ⅡD炮制通则项下盐炙法和制炭法炮制盐杜仲和杜仲炭，根据2010年版《中国药典》质量标准，对盐杜仲和杜仲炭进行各项指标检测，并在此基础上运用液相色谱对生杜仲、盐杜仲、杜仲炭及杜仲叶的化学成分进行比较分析。
1材料
Waters高效液相色谱仪(Waters公司)，分析天平(Sartorious公司)；索氏提取器，Buchi蒸发回流装置(Buchi公司)；蒸发皿，扁形称量瓶，打粉机，烘箱(上海博讯实业有限公司医疗设备厂)。
, 百拇医药
松脂醇二葡萄糖苷、松脂醇、松脂醇二葡萄糖、京尼平、京尼平苷、京尼平酸、咖啡酸、绿原酸、槲皮素对照品购于四川维克奇生物技术有限公司，纯度≥98%。甲酸，分析纯。杜仲药材(南京海源中药饮片有限公司，由南京中医药大学蔡宝昌教授鉴定)；杜仲叶(云南西双版纳)。
2方法与结果
2.1饮片制备盐杜仲：取杜仲块或丝，按照2010年版《中国药典》附录Ⅱ D盐炙法炒至断丝、表面焦黑色。取出，晾凉，得到盐杜仲备用。
杜仲炭：取杜仲块，置锅内，按照2010年版《中国药典》附录ⅡD制炭法用武火炒至颜色加深药材易折断，当有少许火星出现时，迅速取出，用水喷灭，晾凉，得到杜仲炭备用。
2.2色谱条件XBridge C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相：A 为0.1%甲酸-水，B为甲醇。松脂醇二葡萄含量测定的液相色谱条件：0 min，75% B；30 min，75% B；流速1 mL·min-1。检测波长277 nm；柱温30 ℃；进样量10 μL。对照品及杜仲叶水提液的液相色谱条件： 0 min，10% B； 60 min，100% B；70 min，100% B。流速1 mL·min-1；检测波长200～400 nm；柱温30 ℃； 进样量10 μL。
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2.3对照品溶液的制备分别精密称取松脂醇二葡萄糖(PDG)、京尼平、京尼平苷、京尼平酸、咖啡酸、绿原酸、槲皮素对照品1.02，1.01，1.01，1.02，1.00，1.01，1.02 mg，加甲醇制成每1 mL约含1 mg的溶液，即得。
2.4供试品溶液的制备取盐杜仲或杜仲炭约3 g，剪成碎片，用研钵揉成絮状，取约2 g，精密称定，置索氏提取器中，加入三氯甲烷或二氯甲烷适量，加热回流6 h，注意处理三氯甲烷或二氯甲烷蒸气，弃去三氯甲烷或二氯甲烷液，药渣挥去三氯甲烷或二氯甲烷，再置索氏提取器中，加入甲醇适量，加热回流6 h，提取液加热冷凝回收甲醇至适量，转移至10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品。
2.5药典项目检查根据2010年版《中国药典》[4]盐杜仲水分检查要求使用烘干法对盐杜仲和杜仲炭中的水分进行检查，使用总灰分测定法对盐杜仲和杜仲炭中的总灰分进行检查，使用热浸法对盐杜仲和杜仲炭中的醇溶性浸出物进行检查。各检查项结果见表1。根据药典要求水分不得超过13.0%，灰分不得超过10.0%，醇溶物质量分数应超过12.0%，结果表明，盐杜仲上述结果符合标准。杜仲炭目前未被药典收载，也无质量标准。
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2.6线性关系考察精密吸取2，4，6，8，10 μL松脂醇二葡萄糖对照品溶液进样，记录色谱峰，以松脂醇二葡萄糖对照品的浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，计算回归方程y=469 167x-37 308 (R2=0.999 0，n=5)，结果表明松脂醇二葡萄糖在0.24～1.2 g·L-1呈良好的线性关系。
2.7精密度试验取松脂醇二葡萄糖对照品溶液连续进样5次，记录色谱峰峰面积，测得其峰面积的RSD 0.53%。
2.8供试品溶液稳定性试验分别于0， 4， 8，12，24 h，精密吸取上述供试品溶液10 μL，注入液相色谱仪，依法测定，测得峰面积RSD 1.9%，结果表明供试品溶液在24 h内基本稳定。
2.9重复性试验精密称取杜仲粉末，共5份，每份2 g，按2.4项下方法制备供试品溶液，再按2.2项中色谱条件试验，分别进样10 μL，记录色谱图，峰面积RSD 2.8%，结果表明重复性良好。, 百拇医药(陶益 盛辰 李伟东 蔡宝昌 陆兔林)
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[关键词]杜仲；炮制品；液相色谱法
杜仲饮片为杜仲科植物杜仲的干燥树皮，中医临床常用其治疗肾虚腰痛、筋骨无力、妊娠漏血、胎动不安、高血压等[1]。杜仲的主要有效成分包括松脂醇二葡萄糖苷[2]、绿原酸、桃叶珊瑚苷、杜仲胶等[3]，一般以松脂醇二葡萄糖苷为主要指标性成分。盐炙和炒炭是杜仲最为常见的炮制方法，很多学者对杜仲盐炙和炒炭的工艺进行优化，提出了盐杜仲和杜仲炭的最佳炮制工艺及质量要求。本文按照2010年版《中国药典》附录ⅡD炮制通则项下盐炙法和制炭法炮制盐杜仲和杜仲炭，根据2010年版《中国药典》质量标准，对盐杜仲和杜仲炭进行各项指标检测，并在此基础上运用液相色谱对生杜仲、盐杜仲、杜仲炭及杜仲叶的化学成分进行比较分析。
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Waters高效液相色谱仪(Waters公司)，分析天平(Sartorious公司)；索氏提取器，Buchi蒸发回流装置(Buchi公司)；蒸发皿，扁形称量瓶，打粉机，烘箱(上海博讯实业有限公司医疗设备厂)。
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松脂醇二葡萄糖苷、松脂醇、松脂醇二葡萄糖、京尼平、京尼平苷、京尼平酸、咖啡酸、绿原酸、槲皮素对照品购于四川维克奇生物技术有限公司，纯度≥98%。甲酸，分析纯。杜仲药材(南京海源中药饮片有限公司，由南京中医药大学蔡宝昌教授鉴定)；杜仲叶(云南西双版纳)。
2方法与结果
2.1饮片制备盐杜仲：取杜仲块或丝，按照2010年版《中国药典》附录Ⅱ D盐炙法炒至断丝、表面焦黑色。取出，晾凉，得到盐杜仲备用。
杜仲炭：取杜仲块，置锅内，按照2010年版《中国药典》附录ⅡD制炭法用武火炒至颜色加深药材易折断，当有少许火星出现时，迅速取出，用水喷灭，晾凉，得到杜仲炭备用。
2.2色谱条件XBridge C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相：A 为0.1%甲酸-水，B为甲醇。松脂醇二葡萄含量测定的液相色谱条件：0 min，75% B；30 min，75% B；流速1 mL·min-1。检测波长277 nm；柱温30 ℃；进样量10 μL。对照品及杜仲叶水提液的液相色谱条件： 0 min，10% B； 60 min，100% B；70 min，100% B。流速1 mL·min-1；检测波长200～400 nm；柱温30 ℃； 进样量10 μL。
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2.3对照品溶液的制备分别精密称取松脂醇二葡萄糖(PDG)、京尼平、京尼平苷、京尼平酸、咖啡酸、绿原酸、槲皮素对照品1.02，1.01，1.01，1.02，1.00，1.01，1.02 mg，加甲醇制成每1 mL约含1 mg的溶液，即得。
2.4供试品溶液的制备取盐杜仲或杜仲炭约3 g，剪成碎片，用研钵揉成絮状，取约2 g，精密称定，置索氏提取器中，加入三氯甲烷或二氯甲烷适量，加热回流6 h，注意处理三氯甲烷或二氯甲烷蒸气，弃去三氯甲烷或二氯甲烷液，药渣挥去三氯甲烷或二氯甲烷，再置索氏提取器中，加入甲醇适量，加热回流6 h，提取液加热冷凝回收甲醇至适量，转移至10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品。
2.5药典项目检查根据2010年版《中国药典》[4]盐杜仲水分检查要求使用烘干法对盐杜仲和杜仲炭中的水分进行检查，使用总灰分测定法对盐杜仲和杜仲炭中的总灰分进行检查，使用热浸法对盐杜仲和杜仲炭中的醇溶性浸出物进行检查。各检查项结果见表1。根据药典要求水分不得超过13.0%，灰分不得超过10.0%，醇溶物质量分数应超过12.0%，结果表明，盐杜仲上述结果符合标准。杜仲炭目前未被药典收载，也无质量标准。
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2.6线性关系考察精密吸取2，4，6，8，10 μL松脂醇二葡萄糖对照品溶液进样，记录色谱峰，以松脂醇二葡萄糖对照品的浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，计算回归方程y=469 167x-37 308 (R2=0.999 0，n=5)，结果表明松脂醇二葡萄糖在0.24～1.2 g·L-1呈良好的线性关系。
2.7精密度试验取松脂醇二葡萄糖对照品溶液连续进样5次，记录色谱峰峰面积，测得其峰面积的RSD 0.53%。
2.8供试品溶液稳定性试验分别于0， 4， 8，12，24 h，精密吸取上述供试品溶液10 μL，注入液相色谱仪，依法测定，测得峰面积RSD 1.9%，结果表明供试品溶液在24 h内基本稳定。
2.9重复性试验精密称取杜仲粉末，共5份，每份2 g，按2.4项下方法制备供试品溶液，再按2.2项中色谱条件试验，分别进样10 μL，记录色谱图，峰面积RSD 2.8%，结果表明重复性良好。, 百拇医药(陶益 盛辰 李伟东 蔡宝昌 陆兔林)